7 Июля 2019

Биомакромолекулы как инструменты и объекты в нанометрологии - современные проблемы и перспективы

Опубликовал Н.А. Рыков

Нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды являются наиболее важными классами биополимеров.  Свойства, присущие биомакромолекулам, противоречат свойствам четко определенных малых молекул, в связи с чем возникает ряд специфических проблем, которые становятся особенно очевидными, если биомакромолекулы рассматриваются как объекты в количественном анализе.  В то же время, их специфическая функциональная способность молекулярного распознавания и самоорганизации (например, ферментов, антител, ДНК) позволяет нам создавать биомакромолекулы, служащие молекулярными инструментами в биохимии и молекулярной биологии, или точно контролируемые размерные платформы для нанометрических приложений.  Учитывая сложность биомакромолекул, количественный анализ не ограничивается измерением их концентрации, но также включает определение многочисленных дескрипторов, связанных со структурой, взаимодействием, активностью и функцией.  Среди биомакромолекул гликаны служат примерами того, что количественная характеристика не обязательно направлена ​​на измерение концентрации количества вещества, а вместо этого включает определение относительных пропорций (молярных отношений) структурных характеристик для сравнения с теоретическими моделями.

Биомакромолекулы - это природные макромолекулярные соединения, которые составляют основные строительные блоки практически всех типов биологических систем.  Нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды являются наиболее важными классами биополимеров, которые образуются в результате конденсации их мономерных звеньев: нуклеотидов, аминокислот и моносахаридов.  Огромное количество мономеров, связанных вместе во время поликонденсации, и бесчисленные комбинации, которые существуют для их секвенирования, закладывают фундамент для огромного разнообразия и структурной сложности.  Таким образом, биомакромолекулы часто проявляют высокую степень функциональности и способность к разветвлению и / или последующей химической модификации, что облегчает формирование линейных и нелинейных структур 2D / 3D биополимеров.

Таким образом, присущие биомакромолекулам свойства противоречат свойствам четко определенных малых молекул, в связи с чем возникает ряд специфических проблем, которые становятся особенно очевидными, если биомакромолекулы рассматриваются как объекты в количественном анализе.  В то же время, эта специфическая функциональная способность молекулярного распознавания и самоорганизации (например, ферментов, антител, ДНК) позволяет нам делать биомакромолекулы, служащие молекулярными инструментами в биохимии и молекулярной биологии, или как точно контролируемые размерные платформы для нанометрических приложений.  Кроме того, способность к молекулярным взаимодействиям и самоорганизации, сопровождаемая изменением физических свойств, делает биополимеры ценной основой для разработанных биоматериалов, например, в медицине или для использования в контролируемом высвобождении лекарственного средства.  Поскольку требуемые свойства также связаны с размерной структурой доменов, компоненты таких функциональных биоматериалов должны быть тщательно охарактеризованы с точки зрения топологических размеров.

Учитывая сложность биомакромолекул, количественный анализ не ограничивается измерением их концентрации, но также включает определение многочисленных дескрипторов, связанных со структурой, взаимодействием, активностью и функцией.  Однако даже определение концентрации количества вещества в биомакромолекуле требует стратегий, отличных от тех, которые обычно используются для соответствующих мономерных компонентов.

Например, некоторые белки могут служить специфическими индикаторами раннего предупреждения о критических сбоях организма, связанных с распространенными заболеваниями, такими как рак, сердечно-сосудистыми заболеваниями или нейродегенеративными заболеваниями.  Поэтому концентрация этих белковых биомаркеров в жидкостях организма, таких как сыворотка крови, часто измеряется в медицинской диагностике.  Методы, наиболее широко используемые в лабораторной медицине, основаны на иммунохимических реакциях связывания между антителами и белками-мишенями, реализуемых с помощью коммерческих тест-наборов. Хотя признанные методы, такие как масс-спектрометрия с изотопным разбавлением (ID-MS), доказали свою эффективность для небольших молекул, их нельзя просто перенести на цельные белки.  Поэтому разработка методик эталонных измерений для крупных белковых биомаркеров является важной задачей в химической метрологии.

В случае многофункциональных и менее однородных полисахаридов и их производных, мы должны рассмотреть различные типы дисперсности: молекулярной массы и, если применимо, различных компонентов сахара в макромолекулярных цепях, разветвления и расположения заместителей, которые могут быть описаны только количественно с вероятностями, как шаблоны и профили.  Среди биомакромолекул гликаны приводят примеры того, что количественная характеристика не обязательно направлена ​​на измерение концентрации количества вещества, а вместо этого включает определение относительных пропорций (молярных отношений) структурных признаков для сравнения с теоретическими моделями или среднего размера доменов.

Белки: прослеживаемая количественная оценка для выявления и мониторинга заболеваний

За последние два десятилетия сложные биомолекулы, такие как белки, приобретают все более важное значение благодаря их способности действовать в качестве биомаркера для поддержки ранней диагностики и мониторинга широко распространенных заболеваний.  Наиболее часто используемыми стандартными методами для их количественного определения в жидкостях организма человека являются иммунохимические тест-наборы.  Тем не менее, большое разнообразие и сложность белковых маркеров может привести к различным результатам в зависимости от дизайна анализа.  Чтобы обеспечить как прослеживаемость СИ, так и сопоставимость результатов рутинных лабораторных испытаний, необходимы процедуры измерения в срочном порядке.

Хотя большинство признанных эталонных методов в клинической химии основаны на масс-спектрометрии, последние разработки также продемонстрировали способность оптических методов для этой цели, таких как спектроскопия комбинационного рассеяния.  Оба метода объединяют молекулярную специфичность с преимуществами надежности, точности и повторяемости во время количественного анализа, когда применяются в сочетании с концепцией изотопного разбавления (ID).  Изотополог анализируемого вещества, предпочтительно обогащенный 13C или 15N (или обоими), служит внутренним стандартом (спайком), который добавляют к образцу в известном количестве.

Рамановская спектроскопия обеспечивает прямой доступ к структурной информации больших и разнообразных молекул, таких как белки.  Основываясь на молекулярных колебаниях, массовое различие между анализируемым веществом и спайком получается из-за сдвига частот колебаний, в то время как набор специфических колебаний дополнительно обеспечивает средство для однозначной идентификации соединения, включая возможные структурные модификации других подобных соединений.

После разработки и проверки эталонные процедуры измерения для количественной оценки белковых биомаркеров могут также применяться для других диагностических целей, например, для диагностики вирусов.  В случае пациентов, инфицированных ВИЧ (вирусом иммунодефицита человека), мониторинг вирусной нагрузки во время мониторинга терапии осуществляется путем количественного определения вирусной РНК с помощью количественных ПЦР-анализов в реальном времени.  В этих анализах интенсивности флуоресценции сравнивают с интенсивностями ряда внешних стандартов с известными числами копий. Новейшими технологическими разработками в количественных молекулярных подходах являются методы цифровой ПЦР (dPCR), которые позволяют проводить абсолютную количественную оценку инфекционных агентов без внешних стандартов.

ДНК: самоорганизующиеся структуры оригами как образцы для предварительных испытаний биоизображений

ДНК является полезным инструментом в количественном и качественном анализе.  Благодаря своей простой структуре по сравнению с белками и ферментами, её можно довольно хорошо контролировать.  Наиболее важным преимуществом ДНК является сильная и специфическая гибридизация двух отдельных цепей (спаривание оснований Уотсона-Крика).  В зависимости от длины цепи ДНК и выбора оснований, сила связи между двумя одноцепочечными ДНК-фрагментами может регулироваться.  Размер и свойства двухцепочечной ДНК хорошо известны и могут быть использованы для контролируемой самосборки наноустройств (ДНК-оригами) с очень высокими выходами правильно свернутых форм после очистки.  Синтез намного дешевле и быстрее, чем литографическое изготовление наноструктур.

Другим ключевым аспектом ДНК-оригами, помимо быстрой и простой сборки миллиардов идентичных структур в одном эксперименте, является простой способ добавления красителей, наночастиц, белков и других представляющих интерес небольших молекул.  Таким образом, краситель, связанный с ДНК, может быть вставлен в оригами ДНК во время сворачивания, и нить ДНК будет связываться с определенной позицией каркаса.  Другая возможность - расширение объединенной цепи несколькими основаниями (12–15), которые будут указывать в сторону от ДНК-оригами.  После сворачивания ДНК, модифицированная красителем, будет связываться с удлиненной цепью ДНК.  Таким образом, так называемый наноразмерник оригами ДНК может быть разработан с определенным расстояние между двумя красителями.

Важный пример использования наноразрушателей ДНК-оригами был описан профессором Давиде Балзаротти и командой учёных. Они проверили новую микроскопическую установку с наноразрушателями ДНК-оригами, прежде чем отслеживать отдельные субъединицы рибосомного белка 30S. Это показывает, что существует другой метод анализа белков с микроскопией сверхразрешения.  Но белки являются не только объектом интереса;  они также могут быть инструментом в микроскопии сверхвысокого разрешения. Балзаротти заменил органические красители на флуоресцентные белки и использовал их для разделения наноразмерника оригами ДНК, а затем микротрубочек в фиксированных клетках млекопитающих Vero. Флуоресцентные белки имеют преимущество перед органическими красителями в том, что они могут экспрессироваться в живых клетках напрямую и не должны вводиться в клетку. 

В общем, нанолинейки ДНК-оригами дают возможность измерять несколько одинаковых расстояний одновременно. Кроме того, ДНК-оригами можно легко модифицировать для тестирования на разных расстояниях, а также на разных длинах волн.

Заключение и перспективы

Количественная оценка биомакромолекул, которые служат диагностическими маркерами, является сложной задачей в медицинской диагностике на сегодняшний день. В этом контексте доступ к эталонным методикам измерения имеет первостепенное значение, поскольку только эти методы пригодны для адекватного обеспечения необходимого контроля качества в клинической лабораторной медицине.

Самосборные нанолинейки ДНК-оригами являются перспективными наноструктурами, которые служат инструментом для измерений на наноуровне.  Они обычно используются в микроскопии биологических образцов с высоким разрешением, чтобы проверить разрешение в физиологических условиях.  Из-за огромного количества вариантов, которые можно применять для управления конструкцией нанолинейки, может быть реализовано любое возможное расстояние между произвольно выбранными красителями.  Следующим шагом в развитии нанолинеек является использование их в биологических образцах в качестве инструмента сравнения для оценки нанометровых расстояний.

Контакты института

Пн-Вс 8:00 - 19:00

undefined

Ближайшие события

Все события
Новые книги

Свежие новости

Читать все новости