2 Августа 2018

Ландшафты Ракового Генома

Опубликовал Н.А. Рыков

      За последнее десятилетие комплексные усилия по секвенированию выявили геномные ландшафты обычных форм рака человека.  Для большинства типов рака этот ландшафт состоит из небольшого количества «гор» (генов, измененных в большом проценте опухолей) и гораздо большего числа «холмов» (редко изменяющихся генов).  На сегодняшний день в этих исследованиях было обнаружено ~ 140 генов, которые при изменении внутригенных мутаций могут способствовать или «стимулировать» опухолегенез.  Типичная опухоль содержит от двух до восьми из этих мутаций «генов-драйверов»; оставшиеся мутации - это пассажиры, которые не дают преимущества избирательного роста.  Гены водителя можно разделить на 12 сигнальных путей, которые регулируют три основных клеточных процесса: клеточная судьба, выживаемость клеток и поддержание генома.  Лучшее понимание этих путей является одной из наиболее насущных потребностей в фундаментальных исследованиях рака.  Даже сейчас, однако, наши знания о геномах рака достаточны для руководства разработкой более эффективных подходов к снижению заболеваемости и смертности от рака.

      Десять лет назад идея о том, что все гены, измененные при раке, могут быть идентифицированы показалась бы научной фантастикой.  Сегодня такой анализ генома, путем секвенирования экзом или всего генома, является рутинным. 

      Прототипные исследования экзомики рака оценивали ~ 20 опухолей при стоимости> 100 000 долларов за случай.  Сегодня стоимость этого секвенирования снижена, а исследования, сообщающие о последовательности более 100 опухолей данного типа, являются нормой (таблица S1A).  Хотя теперь можно легко получить огромное количество данных, расшифровка этой информации в значимых терминах все еще сложна.  Здесь мы рассмотрим, что было изучено в отношении онкологических геномов из этих исследований секвенирования, и, что более важно, то, что эта информация научила нас биологии рака и будущим стратегиях борьбы с раком.

      Сколько генов субтитно мутируется в типичном раке человека?

      В обычных твердых опухолях, таких как те, которые получены из толстой кишки, молочной железы, мозга или поджелудочной железы, в среднем от 33 до 66 генов проявляют тонкие соматические мутации, которые, как ожидается, изменят их белковые продукты.  Около 95% этих мутаций являются одноосновными заменами (такими как C> G), тогда как остальные - это делеции или вставки одного или нескольких оснований (например, CTT> CT).  Из базовых подстановок 90,7% приводят к сглаженным изменениям, 7,6% приводят к бессмысленным изменениям, а 1,7% приводят к изменениям участков сращивания или нетранслируемых областей, непосредственно примыкающих к кодам начала и конца.

       Определенные типы опухолей показывают гораздо большее или меньшее количество мутаций, чем среднее.  Среди этих выбросов выделяются меланомы и опухоли легких, которые содержат ~ 200 несинхронных мутаций на опухоль.  Эти большие числа отражают участие мощных мутагенов (ультрафиолетового света и сигаретного дыма, соответственно) в патогенезе этих типов опухолей.  Соответственно, рак легких у курильщиков имеет в 10 раз больше соматических мутаций, чем у некурящих.  Опухоли с дефектами в восстановлении ДНК образуют еще одну группу выбросов.  Например, опухоли с дефектами рассогласования могут содержать тысячи мутаций, даже больше, чем опухоли легких или меланомы.  Недавние исследования показали, что большое количество мутаций также обнаружено в опухолях с генетическими изменениями коррекционного домена ДНК-полимераз POLE или POLD1.  На другом конце спектра педиатрические опухоли и лейкозы содержат гораздо меньше точечных мутаций: в среднем 9,6 на опухоль.  Основа для этого наблюдения рассмотрена ниже.

Время мутации

       Когда происходят эти мутации?  Опухоли развиваются от доброкачественных до злокачественных поражений, приобретая серию мутаций с течением времени, процесс, который особенно хорошо изучается при колоректальных опухолях.  Первая мутация или «вращение» обеспечивает селективное преимущество роста в нормальной эпителиальной клетке, позволяя ей перерастать клетки, которые ее окружают, и стать микроскопическим клоном.  Взаимозависимые мутации в толстой кишке чаще всего встречаются в гене APC.  Малая аденома, которая возникает в результате этой мутации, растет медленно, но вторая мутация у другого гена, такого как KRAS, развязывает второй раунд роста клона, что позволяет расширять число клеток.  Клетки с только мутацией APC могут сохраняться, но их число клеток невелико по сравнению с клетками, которые имеют мутации в обоих генах.  Этот процесс мутации, сопровождаемый клональной экспансией, продолжается, с мутациями в генах, таких как PIK3CA, SMAD4 и TP53, в конечном итоге генерируя злокачественную опухоль, которая может проникать через подстилающую мембрану и метастазировать в лимфатические узлы и отдаленные органы, такие как печень.  Мутации, которые придают селективное преимущество росту опухолевой клетке, называются «драйверами» мутаций.  Было подсчитано, что каждая мутация драйвера обеспечивает лишь небольшое преимущество селективного роста для клетки, порядка 0,4% увеличения разницы между рождением клеток и гибелью клеток.  Однако на протяжении многих лет, это небольшое увеличение, составляющее один или два раза в неделю, может привести к большой массе, содержащей миллиарды клеток.

       Количество мутаций в некоторых опухолях самообновляющихся тканей напрямую коррелирует с возрастом.  При оценке с помощью линейной регрессии эта корреляция подразумевает, что более половины соматических мутаций, идентифицированных в этих опухолях, происходят во время предростатической фазы; т. е. при росте нормальных клеток, которые непрерывно пополняют желудочно-кишечный и мочеполовой эпителий и другие ткани.  Все эти пред-неопластические мутации являются «мутациями для пассажиров», которые не влияют на неопластический процесс.  Этот результат объясняет, почему колоректальная опухоль у 90-летнего пациента имеет почти в два раза больше мутаций, чем морфологически идентичная колоректальная опухоль у 45-летнего пациента.  Это открытие также частично объясняет, почему передовые опухоли головного мозга (глиобластомы) и рак поджелудочной железы (панкреатические протоковые аденокарциномы) имеют меньше мутаций, чем колоректальные опухоли; глиальные клетки головного мозга и эпителиальные клетки протоков поджелудочной железы не реплицируются, в отличие от эпителиальных клеток, выстилающих склепы толстой кишки.  Таким образом, предсказание мутации запирания при раке поджелудочной железы или раком мозга происходит в клетке-предшественнике, которая содержит гораздо меньше мутаций, чем в колоректальной клетке-предшественнике.  Эта линия рассуждений также помогает объяснить, почему у педиатрического рака меньше мутаций, чем у взрослых опухолей.  Педиатрические раковые заболевания часто возникают в несамоперерабатывающих тканях, а те, которые возникают при обновлении тканей (например, лейкемии), происходят из клеток-предшественников, которые не обновлялись так часто, как у взрослых.  Кроме того, педиатрические опухоли, а также взрослые лейкозы и лимфомы могут потребовать меньше раундов расширения клона, чем взрослые сплошные опухоли.  Исследования секвенирования генома у пациентов с лейкемией подтверждают идею о том, что мутации происходят как случайные события в нормальных клетках-предшественниках, прежде чем эти клетки приобретают инициирующую мутацию.

       Когда во время опухолевого генеза происходят другие соматические мутации?  Поскольку мутации в опухолях происходят с предсказуемыми и расчетными скоростями, количество соматических мутаций в опухолях обеспечивает часы, подобно часам, используемым в эволюционной биологии, для определения времени расхождения диких видов.  Число мутаций было измерено в опухолях, представляющих прогрессивные стадии колоректального и панкреатического рака.  Применение модели эволюционных часов к этим данным приводит к двум недвусмысленным выводам: во-первых, для разработки полномасштабного метастатического рака требуется несколько десятилетий.  Во-вторых, практически все мутации в метастатических поражениях уже присутствовали в большом количестве клеток в первичных опухолях. 

      Время мутаций имеет отношение к нашему пониманию метастазов, который отвечает за смерть большинства пациентов с онкологическими заболеваниями.  Первичная опухоль может быть удалена хирургическим путем, но остаточные метастатические поражения, часто необнаруживаемые и широко распространенные, остаются и в конечном итоге увеличиваются, нарушая работу легких, печени или других органов.  С точки зрения генетики, казалось бы, должны быть мутации, которые превращают первичный рак в метастатический, точно так же, как существуют мутации, которые превращают нормальную клетку в доброкачественную опухоль или доброкачественную опухоль к злокачественной.  Тем не менее, несмотря на интенсивные усилия, последовательные генетические изменения, которые различают раковые опухоли, которые метастазируют от рака, которые еще не метастазируются, еще предстоит идентифицировать.

       Одно потенциальное объяснение вызывает мутации или эпигенетические изменения, которые трудно идентифицировать с помощью современных технологий.  Другим объяснением является то, что метастатические поражения еще недостаточно изучены для выявления этих генетических изменений, особенно если мутации являются гетерогенными по своей природе.  Но еще одно возможное объяснение состоит в том, что нет метастазирующих генов.  Злокачественная первичная опухоль может занять много лет, чтобы метастазировать, но этот процесс, в принципе, объясняется только стохастическими процессами.  Продвинутые опухоли выделяют миллионы клеток в кровообращение каждый день, но эти клетки имеют короткие периоды полураспада, и только незначительная фракция устанавливает метастатические поражения.  По-видимому, эти циркулирующие клетки могут, недетерминированным образом, редко и беспорядочно размещаться в капиллярном слое в органе, который обеспечивает благоприятное микроокружение для роста.  Чем больше первичная масса опухоли, тем вероятнее, что этот процесс будет происходить.  В этом случае непрерывная эволюция первичной опухоли будет отражать местные избирательные преимущества, а не будущие избирательные преимущества.  Идея о том, что рост на метастатических местах не зависит от дополнительных генетических изменений, также подтверждается недавними результатами, показывающими, что даже нормальные клетки, помещенные в подходящие среды, такие как лимфатические узлы, могут вырасти в органоиды, в комплекте с функционирующей сосудистой сетью.

Другие типы генетических изменений в опухолях

       Хотя скорость точечных мутаций в опухолях аналогична скорости нормальных клеток, скорость хромосомных изменений в раке повышается.  Поэтому большинство твердых опухолей демонстрируют широко распространенные изменения в числе хромосом (анеуплоидия), а также делеции, инверсии, транслокации и другие генетические аномалии.  Когда большая часть хромосомы дублируется или удаляется, трудно идентифицировать специфический «целевой» ген (гены) на хромосоме, чье усиление или потеря дает преимущество роста опухолевой клетке.  Целевые гены легче идентифицировать в случае транслокаций хромосом, гомозиготных делеций и генных амплификаций.  Транслокации обычно сливают два гена для создания онкогена (такого как BCR-ABL при хроническом миелогенном лейкозе), но в небольшом числе случаев могут инактивировать ген супрессора опухоли путем усечения его или отделения его от его промотора.  Гомозиготные делеции часто включают только один или несколько генов, и мишень всегда является геном супрессора опухоли.  Амплификации содержат онкоген, белковый продукт которого аномально активен просто потому, что опухолевая клетка содержит от 10 до 100 копий гена на клетку по сравнению с двумя копиями, присутствующими в нормальных клетках.

       Большинство твердых опухолей имеют десятки транслокаций; однако, как и в случае точечных мутаций, большинство транслокаций, по-видимому, являются пассажирами, а не водителями.  Точки остановки транслокаций часто встречаются в «генных пустынях», лишенных известных генов, и многие из транслокаций и гомозиготных делеций примыкают к хрупким участкам, подверженным разрушению.  Раковые клетки могут, возможно, выживать в таких хромосомных ломах легче, чем обычные клетки, потому что они содержат мутации, которые выводят из строя гены, такие как TP53, которые обычно реагируют на повреждение ДНК, вызывая гибель клеток.  Исследования на сегодняшний день указывают на то, что в хромосомных изменениях в примерно 10 раз меньше генов, чем при точечных мутациях.  Гены, кодирующие белки, составляют всего ~ 1,5% от общего генома, а количество изменений в некодирующих областях пропорционально выше, чем число, влияющее на кодирующие области.  Подавляющее большинство изменений в некодирующих регионах, по-видимому, являются пассажирами.

Мутации водителя против мутаций пассажира

       Хотя в физиологических терминах легко определить «мутацию гена драйверов» (как один, обеспечивающий преимущество селективного роста), определить, какие соматические мутации являются водителями и которые являются пассажирами, сложнее.  Кроме того, важно отметить, что существует фундаментальное различие между геном-водителя и мутацией гена-водителя.  Ген-водитель - это тот, который содержит мутации гена водителя.  Но гены водителя могут также содержать мутации пассажирских генов.  Например, APC является большим геном-драйвером, но только те мутации, которые усекают кодированный белок в его N-концевых аминокислотах 1600, являются мутациями гена-водителя.  Миссенс-мутации по всему гену, а также мутанты, усекающие белки с-концевых аминокислотах, являются мутациями пассажирских генов.

       Описаны многочисленные статистические методы идентификации генов-драйверов.  Некоторые из них основаны на частоте мутаций в отдельном гене по сравнению с частотой мутаций других генов в тех же или родственных опухолях после коррекции для контекста последовательности и размера гена.  Другие методы основаны на предсказанных эффектах мутации на закодированном белке, как это было сделано из биофизических исследований.  Все эти методы полезны для определения приоритетности генов, которые, скорее всего, будут способствовать селективному преимуществу роста при мутировании.  Когда число мутаций в гене очень велико, как и у TP53 или KRAS, любая разумная статистика указывает на то, что ген, скорее всего, будет геном-драйвером.  Эти сильно мутированные гены называются «горами».  К сожалению, однако, гены с более чем одним, но все же относительно небольшим количеством мутаций (так называемые «холмы») численно доминируют в ландшафтах генома рака.  В этих случаях методы, основанные только на частоте мутации и в контексте, не могут достоверно указывать, какие гены являются водителями, потому что фоновые частоты мутации сильно различаются у разных пациентов и регионов генома.  Недавние исследования нормальных клеток показали, что частота мутаций варьируется более чем в 100 раз в геноме.  В опухолевых клетках это изменение может быть выше и может влиять на целые области генома, по-видимому, случайным образом.  Таким образом, в лучшем случае методы, основанные на частоте мутации, могут только определять приоритеты генов для дальнейшего анализа, но не могут однозначно идентифицировать гены водителя, которые мутируются на относительно низких частотах.

Глоссарий

Аденома: доброкачественная опухоль, состоящая из эпителиальных клеток. 

Альтернативное удлинение теломер (ALT): процесс поддержания теломер независимо от теломеразы, фермента, обычно ответственного за репликацию теломер. 

Усиление: генетическое изменение, производящее большое количество копий небольшого сегмента (менее нескольких мегабаз) генома. 

Ангиогенез: процесс формирования сосудистых каналов, включая вены, артерии и лимфатические сосуды. 

Доброкачественная опухоль: аномальная пролиферация клеток, обусловленная, по меньшей мере, одной мутацией в генах онкогена или опухолевого супрессора.  Эти клетки не являются инвазивными (то есть они не могут проникать в подвальную мембрану, выстилающую их), что отличает их от злокачественных клеток. 

Карцинома: тип злокачественной опухоли, состоящей из эпителиальных клеток. 

Клональная мутация: мутация, которая существует в подавляющем большинстве неопластических клеток в опухоли. 

Мутация гена водителя (драйвера): мутация, которая прямо или косвенно дает преимущество избирательного роста в клетке, в которой оно происходит. 

Ген водителя: ген, который содержит мутации гена водителя (ген Mut-Driver) или выражен аберрантно таким образом, что дает преимущество селективного роста (ген Epi-Driver).   

Эпигенетический: изменения в экспрессии генов или клеточный фенотип, вызванные механизмами, отличными от изменений в последовательности ДНК. 

Экзома: коллекция экзонов в геноме человека.  Секвенирование экзомы обычно относится к коллекции экзонов, которые кодируют белки. 

Род генома: геном индивидуума, унаследованный от родителей.   

Кариотип: отображение хромосом клетки на микроскопическом слайде, используемое для оценки изменений числа хромосом, а также структурных изменений хромосом. 

Киназа: белок, который катализирует добавление фосфатных групп к другим молекулам, таким как белки или липиды.  Эти белки необходимы для почти всех путей передачи сигналов. 

Жидкие опухоли: опухоли, состоящие из гемопоэтических (кроветворных) клеток, таких как лейкозы.  Хотя лимфомы обычно образуют твердые массы в лимфатических узлах, их часто классифицируют как жидкие опухоли из-за их происхождения из гемопоэтических клеток и способности проходить через лимфатические сосуды. 

Злокачественная опухоль: аномальная пролиферация клеток, вызванная мутациями в онкогенах или генах супрессоров опухолей, которые уже вторглись в их окружающую строму.  Невозможно отличить изолированную доброкачественную опухолевую клетку от изолированной злокачественной опухолевой клетки.  Это различие может быть сделано только путем изучения тканевой архитектуры. 

Метастатическая опухоль: злокачественная опухоль, которая мигрировала из своего первичного участка, например, для слива лимфатических узлов или другого органа. 

Метилирование: ковалентное присоединение метильной группы к белку, ДНК или другой молекуле. 

Миссенс-мутация: однонуклеотидное замещение (например, С-Т), которое приводит к аминокислотной замене (например, гистидину в аргинин).