26 Июня 2019

Микробиом кишечника младенцев и влияние лечения антибиотиками на разнообразие штамма бактерий

Опубликовал Н.А. Рыков

Несмотря на широкое использование антибиотиков среди детей, эффекты их воздействия на развивающийся микробиом кишечника  младенцев остается недостаточно изученным.  Процесс исследования, описанный здесь, покажет, как кишечный микробиом реагирует на антибиотики и восстанавливается после них.  У детей,  проходивших лечение антибиотиком, были менее стабильные и менее разнообразные бактериальные сообщества.  Гены устойчивости к антибиотикам в кишечнике этих детей достигали пика после лечения антибиотиками, но обычно быстро возвращались к исходному уровню. Способ введения также оказал сильное долгосрочное влияние на разнообразие микроорганизмов. Данные здесь дадут представление о влиянии факторов ранней жизни, таких как способ рождения и лечение антибиотиками, на микробиом кишечника младенца.

Микробное сообщество кишечника отличается своей динамичностью в течение первых 3 лет жизни, прежде чем стабилизируется до состояния, подобного взрослому.  Однако мало что известно о влиянии факторов окружающей среды на развивающийся кишечный микробиом человека. В кишечном микробиоме большинства детей, родившихся при вагинальных родах, преобладали виды бактероидов (Bacterorids), у четверых детей, рожденных путем кесарева сечения, и около 20% детей, родившихся вагинально, не наблюдались бактероиды в первые 6–18 месяцев жизни.  Продолжительный отбор проб в сочетании с секвенированием цельного генома позволил выявить изменение уровня штамма, а также обилие генов устойчивости к антибиотикам.  Микробиота детей, которые получали антибиотик, была менее разнообразной с точки зрения, как бактериальных видов, так и штаммов.  Кроме того, наблюдались кратковременные изменения состава между последовательными образцами от детей, получавших антибиотики.  Гены устойчивости к антибиотикам, содержащиеся в микробных хромосомах, были на пике своего изобилия после лечения антибиотиками, за которым последовало резкое снижение, в то время как некоторые гены, несущие подвижные элементы, сохранялись дольше после окончания терапии антибиотиками. Результаты подчеркивают ценность длительных исследований с высокой выборкой с профилированием деформации высокого разрешения для изучения реакции на раздражение микробиома кишечника младенца.

Обсуждение

Коллектив ученых наблюдал за развитием кишечного микробиома у 39 детей путем плотного отбора проб кала в течение 3-летнего периода и изучения взаимосвязи между такими факторами, как способ рождения (вагинальный или кесарево сечение), детское питание (грудное молоко или молочная смесь), и  воздействие антибиотиков.  Плотный отбор проб с одного ребенка вместе с глубоким метагеномным секвенированием, который способствовал распознаванию отдельных штаммов внутри видов, позволил нам охарактеризовать развивающийся микробиом кишечника младенца и эффект повторного воздействия антибиотиков при беспрецедентном разрешении.

Младенцы в первые 6 месяцев жизни продемонстрировали обилие видов Bacteroides. В литературе были противоречивые сообщения о типичном микробном профиле у детей.  Многочисленные исследования показали, что дети, рожденные с помощью кесарева сечения, имеют низкий уровень бактериоидов, в то время как дети, рожденные вагинально, имеют более высокие уровни бактероидов.  Кроме того, одно исследование и обзор описали виды  Bacteroides как типичный профиль для всех детей.  Наше исследование показывает, что низкое содержание бактероидов не ограничивается только детьми, рожденными с помощью кесарева сечения.  Принимая во внимание, что их низкий уровень наблюдался у всех детей в группе, рожденных путем кесарева сечения, а также у 7 из 35 (20%) детей, родившихся вагинально.  Различия не могут быть объяснены техническим изменением, потому что сигнал является чрезвычайно сильным и продолжительным: численность видов Bacteroides исключительно высока (в среднем 45%), и мы наблюдаем это в нескольких временных отрезках на каждого ребенка.

Ученые тщательно искали клинические переменные, которые могли бы объяснить низкий уровень бактероидов у детей, родившихся вагинально (включая воздействие на матерей, продолжительность родов и использование клизмой матери до родов), но только с семью детьми не получилось выявить какие-либо переменные,  которые были статистически связаны с разницей.  Предыдущие исследования показали, что роды через кесарева сечение могут влиять на уменьшением микробного разнообразия даже в возрасте 2 лет. Последние результаты критически расширяют этот вывод, демонстрируя, что уменьшение микробного разнообразия наблюдается у детей с признаком низкого уровня бактероидов независимо от способа их рождения.  Снижение микробного разнообразия сохранялось даже в 36 месяцев, когда бактероиды стали очень распространенными среди детей с низким уровнем бактерий.  Низкое содержание бактероидов заслуживает дальнейшего изучения, чтобы определить причину этого явления и понять последствия связанные с этим уменьшением разнообразия микроорганизмов.

Используя обширные метагеномные данные, ученые идентифицировали организмы на уровне видов и  штаммов, предлагая нам возможность изучать разнообразие микробных сообществ с гораздо более высоким разрешением.  Использование антибиотиков связывают с уменьшением микробного разнообразия в возрасте 3 лет, особенно на уровне штамма.  Было высказано предположение, что уменьшение разнообразия сообществ может ограничить способность иммунной системы `изучать` и адаптироваться, в том числе её способности распознавать комменсальные бактерии, и может привести к менее устойчивым микробным сообществам.

Результаты группы учёных также проливают свет на устойчивость кишечного микробиома, что связано со способностью экосистемы восстанавливать равновесие после вмешательств.  В экологии нарушения экосистемы на постоянной основе считаются особенно вредными, когда очередной раз наступает до того, как экосистема успела оправиться от предыдущего раза.  Сообщалось, что микробиом кишечника у взрослых после однократного воздействия антибиотиками восстанавливается  в течение примерно 2 недель, но многократное лечение может привести к значительному увеличению этого периода времени.  Мы обнаружили, что у детей, получавших антибиотики, были менее стабильные кишечные микробиомы по сравнению с детьми не на антибиотиках.  Хотя микробиом кишечника, по-видимому, возвращается к исходному уровню в течение 1 месяца на основе таксономической классификации, нельзя исключать долгосрочные эффекты, которые не отражаются в измерениях учёных.

Лечение антибиотиками соответствовало кратковременной нестабильности микробного сообщества;  однако после лечения не наблюдалось воспроизводимых изменений бактериального состава, даже при рассмотрении каждого класса антибиотиков в отдельности.  Поскольку ответная реакция на антибиотик может произойти в течение нескольких недель, возможно, что более плотный отбор проб выявит краткосрочные ответные реакции на лечение антибиотиками.  Альтернативно, возможно, что вариация в ответных реакциях отражает уникальные факторы каждого индивидуума, основываясь на предыдущем микробном состоянии, генетике хозяина и / или общем состоянии заболевания.  В другом опубликованном исследовании, сравнивалось одинаковое количество детей, на которых оказывалось воздействие антибиотиками и без него, с использованием популяции, родившейся в Соединенных Штатах, в которой частота кесарева сечения была выше, чем в предыдущей группе. 

Одним из важных последствий применения антибиотиков является распространение генов устойчивости к антибиотикам, что является серьезной проблемой общественного здравоохранения.  После воздействия антибиотиков наблюдали два альтернативных паттерна обилия генов устойчивости к ним в зависимости от их геномного контекста: (i) гены, содержащиеся в микробной хромосоме, имели тенденцию демонстрировать сильный пик в изобилии после лечения с последующим резким снижением, и (ii) гены на мобильных ген. элементах имели тенденцию сохраняться намного дольше после отмены антибиотика.  Откуда произошли эти гены, остается неясным; также было обнаружено присутствие генов устойчивости к антибиотикам у детей в возрасте 2 месяцев перед воздействием любых антибиотиков. Предыдущие исследования также показали, что у некоторых новорожденных есть гены устойчивости к антибиотикам, которые потенциально могут быть наследованы от их матерей.

Область микробиома кишечника в педиатрии все еще нова, с относительно небольшим количеством крупных исследований, которые включают плотный продольный отбор проб и множественные клинические ковариаты. Работа, описанная выше, вносит неожиданные свойства в эту область, включая высоко индивидуализированные микробные профили младенцев и различные реакции этих микробных сообществ на антибиотики.  Дизайн исследования действительно ограничивал некоторые анализы, включая оценку индивидуальных эффектов каждого курса антибиотиков, потому что высокая частота лечения не позволяла провести независимый анализ каждого курса.  Кроме того, сбор образцов до 2-месячного возраста обеспечил бы более полную картину раннего развития микробиома.  Последующие исследования, изучающие события ближе к родам, будут иметь решающее значение для понимания происхождения этих индивидуальных микробных профилей, а также для определения потенциальных источников генов устойчивости к антибиотикам.  К счастью, улучшенные методы секвенирования и анализа делают все более возможным выяснение естественной истории микробного сообщества кишечника младенца, включая долгосрочные последствия вмешательств, таких как антибиотики и кесарево сечение.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Основной целью исследования, описанного в этой статье было использование плотного продольного отбора образцов в микробном сообществе кишечника у детей для мониторинга изменений с течением времени.  Были исследованы конкретные переменные, включая способ родов и применение антибиотиков.  Искали кандидатов для исследования в Финляндии в период с сентября 2008 года по май 2010 года. Критерии участия в этом исследовании включали в себя либо полное отсутствие, либо не более 9 курсов антибиотиков в течение первых 3 лет жизни.  Участвующие дети подвергались проспективному мониторингу на предмет инфекций, использования антибиотиков и других событий из жизни.  Данные о грудном вскармливании и введении прикорма регистрировались в учебном буклете и интервью при каждом учебном визите (3, 6, 12, 18, 24 и 36 месяцев).

Сбор образцов стула и ДНК

Образцы стула были собраны родителями участников и сохранены в домашнем морозильнике (-20°C) до следующего запланированного посещения местного учебного центра;  образцы затем отправлялись в основную лабораторию.  Образцы хранили при -80°С до отправки в Институт Гарварда для экстракции ДНК.  Экстракция ДНК из стула проводилась с использованием мини-набора QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen).

Измерение генов устойчивости к антибиотикам

Для обнаружения и количественного определения  генов устойчивости к антибиотикам, ученые использовали ShortBRED (- это система для профилирования семейств белков с очень высокой специфичностью в данных метагеномного секвенирования.).  Вкратце, учитывая набор цепей белков устойчивых к антибиотикам, ShortBRED группирует их в сходные семейства на основе их последовательности, выделяет набор отличительных строк («маркеров») для каждого семейства и затем ищет эти маркеры в метагеномных данных.  Во внимание не принимались гены, которые обычно присутствуют в основном геноме вида и в которых точечные мутации могут вызывать устойчивость к антибиотикам, поскольку необходим очень высокий охват для идентификации этих мутаций.  Вместо этого учёные были сосредоточены на генах, присутствия которых достаточно, чтобы оказать сопротивление.